Technika RISA – analyza medzigenovych sekvencii ribozomalnej RNA
Co je RISA?
RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) je metoda pouzivana na analyzu roznych typov mikroorganizmov. Umoznuje porovnavat bakterialne kultury, ktore sa lisia prostredim, v ktorom ziju, alebo sposobom osetrenia. Ide o metodu, ktora umoznuje analyzu mikrobialnych spolocenstiev bez skreslenia sposobeneho kultivaciou. RISA je znama aj pod nazvom community fingerprinting.
Priebeh metody
Technika RISA je zalozena na PCR amplifikacii oblasti operonu genu rRNA, ktora sa nachadza medzi malou (16S) a velkou (23S) ribozomalnou podjednotkou. Tato oblast sa oznacuje ako intergenovy spacer (ISR). Pouzitim oligonukleotidovych primerov zameranych na konzervovane oblasti 16S a 23S mozno vytvorit fragmenty RISA z vacsiny dominantnych bakterialnych genov pritomnych vo vzorke zivotneho prostredia.
Na rozdiel od vacsiny operonu rRNA, ktory plni predovsetkym strukturnu funkciu, mozu fragmenty ISR v zavislosti od bakterialneho druhu kodovat aj tRNA. Taxonomicka hodnota oblasti ISR spociva vo vysokej variabilite ich dlzky aj nukleotidovej sekvencie.
Pri metode RISA sa vyuziva variabilita dlzky oblasti ISR, ktora sa pohybuje priblizne od 150 do 1500 parov baz.
Produkt ziskany pomocou PCR predstavuje zmes fragmentov pochadzajucich od niekolkych dominantnych bakterialnych populacii. Nasledne sa analyzuje polyakrylamidovou gelovou elektroforezou a DNA sa vizualizuje po zafarbeni.
Vysledkom elektroforezy je charakteristicky obrazec pasov, ktory predstavuje druhovo specificky profil. Kazdy pas DNA zodpoveda urcitej bakterialnej populacii.
Co je fingerprint technika?
Fingerprint technika je laboratorna metoda pouzivana na urcenie pravdepodobnosti identity osoby na zaklade nukleotidovych sekvencii vybranych oblasti DNA, ktore su pre kazdeho jednotlivca jedinecne. Analyza DNA sa vyuziva pri kriminalistickych vysetrovaniach, vo forenznej praxi aj pri testoch otcovstva. V tychto pripadoch sa porovnavaju dve vzorky DNA s cielom zistit ich zhodu.
Pri mikrobiologii umoznuje fingerprint technika hodnotit rozdiely medzi mikrobialnymi populaciami, neposkytuje vsak priamu informaciu o ich taxonomickom zaradeni.
Co mozeme identifikovat pomocou RISA?
Pomocou metody RISA mozno identifikovat bakteriu Enterococcus cecorum. Patri medzi oportunisticke patogeny a moze sposobovat ochorenia u ludi, najma nemocnicne infekcie, ako aj u kuriat a holubov. V poslednych rokoch je povazovana za vyznamnu hrozbu pre hydinarsky priemysel na celom svete.
Infekcia touto bakteriou u kuriat moze sposobit sepsu, endokarditidu alebo v tazkych pripadoch nekrózu mozgu a encefalomalaciu.
U ludi sa tato bakteria vyskytuje len zriedkavo, boli vsak zaznamenane pripady infekcie poopercnych herniovych sietok a kolonizacie mocovych ciest.
